1 项目背景

近年来，随着高通量测序技术的发展，三代测序逐渐成为基因组研究的新兴手段。Pacbio、Nanopore等第三代测序技术有效的解决了二代测序读长短，无法跨过基因组高重复区域的问题。当下，Nanopore测序技术作为三代测序的后起之秀，因其读长长、产出高、价格低的优势开始被广泛应用于测序界。该平台利用纳米孔进行实时测序，没有读长限制，可以直接读取超长片段的序列信息，得到超长的reads。

1.1 Nanopore测序平台

诺禾致源引入的基于Nanopore测序原理的PromethION平台是继便携式MinION和台式设备GridION之后Oxford Nanopore Technologies（简称ONT）推出的最新超高通量测序仪。PromethION具有48个独立测序芯片，可以单独或同时运行，每张测序芯片包含多达3000个有效通道，一次总共可有多达144000个有效通道进行测序。该平台具有测序通量高、测序成本低、测序周期短等特点。

1.2 Nanopore测序原理

Nanopore测序即纳米孔测序，其原理是：纳米孔蛋白作为生物传感器，插入由合成聚合物形成的膜中。此外，核酸分子会与马达蛋白（Motor Protein）连接，该马达蛋白一方面对双链进行解链，使核酸单链在电泳的作用下通过特定的纳米孔蛋白，另一方面可控制DNA/RNA分子的移动速度，保证碱基逐一地穿过纳米孔，产生稳定可靠的电信号。由于不同碱基的带电性质不同，通过检测电信号的差异就能检测出通过纳米孔的碱基类别，实现测序。

Figure. 1 Nanopore测序原理

1.3 Nanopore测序优势

1. 超长的测序读长，平均读长大于15Kb，最长读长能达到2M，可以跨域大范围的基因组重复区域进行测序，减少组装错误;

2. 更高的测序通量，PromethION平台的测序芯片包含多达3000个有效通道，一次总共可有多达144000(3000 * 48)个有效通道进行测序，平均单个cell产出在40-60Gb;

3. 无PCR扩增偏向性，建库过程中不需要进行DNA的PCR扩增，避免了覆盖度不均一及PCR冗余.

2 建库测序流程

从DNA样品到最终数据获得，样品检测、建库、测序每一个环节都会对数据质量和数量产生影响，而数据质量又会直接影响后续信息分析的结果。为了从源头上保证测序数据的准确性、可靠性，诺禾致源对样品检测、建库、测序每一个生产步骤都严格把控，从根本上确保了高质量数据的产出。

2.1 DNA样品检测

诺禾致源对DNA样品的检测主要包括2种方法：

  (a)脉冲场电泳分析DNA降解程度以及是否有污染;

   (b)Qubit对DNA浓度进行精确定量。

样品质量标准如下：

图2 样品质量标准

2.2 文库构建

基因组DNA可以选择是否通过Covaris g-TUBE来打断和片段筛选。经损伤修复和加A尾后，再在片段两端分别连接测序接头，制备DNA文库，如图所示：

图3 ONT建库过程

2.3 上机测序

库检合格，根据文库的有效浓度及数据产出需求使用PromethION平台进行测序。

3 结果展示及说明

3.1 原始数据处理

PromethION测序平台是基于纳米孔的单分子实时测序技术，原始测序数据为Fast5格式文件，其中包括了测序时的电信号值等数据，我们采用Guppy软件对该文件进行basecalling得到碱基信息，储存为Fastq文件，并进行后续的分析。

3.2 Nanopore数据统计

对basecalling得到的数据采用软件NanoPlot进行质控及数据过滤，我们对下机得到的reads统计结果见表2、3及图3、4：

Table 1. Raw Data Summary

Table 2. Top 5 longest reads

图4 读长分布直方图

图5 读长及平均质量值分布图

4 Note

1. Open the result file with a professional text editor, such as Excel or EditPlus.

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5 References

[1] Van Broeckhoven C, Cruts M, De Coster W, et al. NanoPack: visualizing and processing long-read sequencing data[J]. Bioinformatics, 2018, 34(15): 2666-2669.

[2] Leggett R M, Clark M D. A world of opportunities with nanopore sequencing[J]. Journal of experimental botany, 2017, 68(20): 5419-5429.

[3] Van Dijk E L, Jaszczyszyn Y, Naquin D, et al. The Third Revolution in Sequencing Technology[J]. Trends in Genetics, 2018.